细胞芯片-细胞免疫芯片检测

体外细胞培养的核心技术问题是模拟体内微环境，使细胞测试结果真实反映体内状态。传统二维细胞培养技术在微环境模拟、测试通量以及操作自动化等方面均难以满足临床需求。以微流控芯片为基础构建芯片三维细胞培养平台，以建立细胞间的联系，模拟体内组织特征。此外，为了进一步符合仿生特点，微环境中细胞间质相互作用及流体运输方式的模拟也是需要考虑的问题。

一wb

免疫印迹（ ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 

一、原理 

与或杂交方法类似，但 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 

二、试剂准备 

1、试剂见电泳实验。 

2、匀浆缓冲液：10m  681oml；10sds 60ml；β巯基乙醇 02ml；ddh2o 28ml。 

3、转膜缓冲液：甘氨酸 29g； 58g；sds 037g；甲醇200ml；加ddh2o定容至ml。 

4、001m 74： 80g；kcl 02g；na2hpo4 144g；kh2po4 024g；加ddh2o至ml。 

5、膜染色液：考马斯亮兰 02g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddh2o118 ml。包被液（5脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉10g 溶于20ml的001m pbs中。 

6、显色液：dab 60mg；001m pbs 100ml；硫酸镍胺 01ml；h202 10μl。 

三、操作步骤 

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆051min。然后4℃，g离心15min。取上清液作为样品。 

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行。 

（三）转移：（半干式转移） 

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。 

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。 

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、nc膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源恒流2，转移15hr。转移结束后，断开电源将膜取出割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 

（四）免疫反应： 

1、用001m pbs洗膜，5min ×3次。 

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。 

3、弃包被液，用001m pbs洗膜，5min×3次。 

4、加入一抗（按合适稀释比例用001m pbs稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1bsa取代一抗，其余步骤与实验组相同。 

5、弃一抗和1bsa，用001m pbs分别洗膜，5min×4次。 

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用001m pbs稀释），平稳摇动，室温2hr。 

7、弃二抗，用001m pbs洗膜，5min×4次。 

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 

四、注意事项 

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入h2o2。 

3、dab有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

（二）ihc

免疫组织化学 ihc

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。

免疫组织化学的全过程包括：1抗原的提取与纯化；2免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4标本的制备；5免疫细胞化学反应以及呈色反应；6观察结果。

免疫组化基础知识

免疫组织化学的概念： 

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 荧光素、酶、金属离子、同位素 显色来确定组织细胞内抗原多肽和蛋白质，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 

免疫组化实验所用的抗体有哪些？

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个b淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个b淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 

免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 

石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行ihc染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是ph60的001 的柠檬酸盐缓冲液。 

免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原抗体在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

抗体交叉反应的原因：

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：

1 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。

2 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。

3 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。 

多抗和单抗特性比较：

1均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类ig的混合物。 

2 稳定性。单抗的稳定较差，对ph变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。 

3 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。 

4重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。 

5 沉淀反应。多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。

抗体的保存：

抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（mgl），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。

被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入001叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置20℃以下可保存35年。保存稀释后的单抗应加入01叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。

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